Ўзбекистон Республикасининг «Ветеринария тўғрисида»ги Қонуни талабларини бажариш мақсадида Ўзбекистон Республикаси Вазирлар Маҳкамасининг 2007 йил 21 декабрдаги 03-38-144-сонли Баёнига мувофиқ буюраман:

1. Паррандаларнинг вирусли грипп касаллиги қўзғатувчисига антителаларни аниқлаш учун тест-йиғмани қўллаш бўйича Қўлланма иловага мувофиқ тасдиқлансин.

2. Мазкур ҳужжат Ўзбекистон Республикаси Адлия вазирлигида давлат рўйхатидан ўтказилган кундан бошлаб 10 кун ўтгандан кейин кучга киради.

3. Мазкур буйруқнинг ижросини назорат қилиш бошлиқ ўринбосари М. Юсупов зиммасига юклатилсин.

1. Тест-йиғма кимёвий ҳамда иммунологик реагентларнинг тўлиқ йиғмасидан иборат бўлиб, Иммун-фермент анализ (ИФА) усули билан паррандаларнинг вирусли грипп касаллиги Avian Influenca (AI) антителаларини аниқлаш имконини беради.

2. Тест-йиғма таркибига қуйидаги жадвалда кўрсатилган реагентлар киради:

3. Кўрсатилган миқдордаги реагентлар ҳамда компонентлар 480 та парранда қон зардоби намунасини текшириш имконини беради.

4. Субстрат. Субстрат тайёрлаш учун 1 дона таблетка 5,5 мл субстратли буферга қўшилади ва 3 дақиқа давомида ёки тўла эригунга қадар аралаштирилади. Тайёрланган реагент кун давомида ишлатилгани маъқул, бироқ у қоронғи жойда +4°С ҳароратда сақланганда бир ҳафта давомида барқарор туради. Таблеткалар тоза идишга солинади ва тегишли ҳажмдаги субстратли буфер қўшилади. Таблетка билан ишлашда қўлқоплар кийилади.

5. Ювувчи буфер. Ювувчи буфернинг бир пакети бир литр дистилланган ёки деионлаштирилган сувга солинади ва тўла эригунга қадар аралаштирилади. Ювувчи буфер +4°С ҳароратда сақланганда 1 ой давомида барқарор туради.

6. Йиғманинг қолган барча компонентлари ишлатиш учун тайёр, бироқ ишлатишдан олдин хона ҳароратигача (22—27°С) илитилиши керак.

7. Ҳар бир намуна 1:500 нисбатда 1 мкл миқдорида 0,5 мл намуна эритувчисига қўшиш йўли билан аралаштирилади.

а) вортекс ёрдамида ёки пробиркани чайқатилиб яхшилаб аралаштирилади.

б) ҳар бир намуна учун тоза учлик ишлатилади.

в) аралашмали пробиркага намуна рақами ёзилади. Йиғманинг ижобий ва салбий назоратлари эритилмаслиги шарт!

Йиғманинг ижобий ва салбий назоратлари эритилмаслиги шарт!

8. Тест қуйидаги босқичларда ўтказилади:

а) берк пакетдан AI антигени билан қопланган планшетлар олинади ва шаблонда намуналар жойлашиши белгиланади;

б) А1 ва В1 чуқурчаларига 100 мкл дан салбий назорат қўшилади;

в) С1 ва D1 чуқурчаларига 100 мкл дан ижобий назорат қўшилади;

г) тегишли чуқурчаларга 100 мкл дан эритилган намуналар қўшилади. Планшет қопқоғи билан ёпилади ва хона ҳароратида (22—27°С) 30 дақиқа инкубация қилинади;

д) чуқурчалар ичидаги суюқлик сўриб олинади ва 4 марта ювувчи буфер билан ювилади (ҳар бир чуқурчага 300 мкл дан). Планшет ағдарилади ва фильтрловчи қоғозга зич босилиб тақиллатилади.

е) тегишли чуқурчаларга 100 мкл дан конъюгат қўшилади. Планшет қопқоқ билан ёпилади ва хона ҳароратида (22-27°С) 30 дақиқа давомида инкубация қилинади;

ё) ювиш жараёни 5 бандда ёзилгани сингари такрорланади;

ж) тегишли чуқурчаларга 100 мкл дан субстрат қўшилади. Планшет қопқоқ билан ёпилади ва хона ҳароратида (22—27°С) 15 дақиқа давомида инкубация қилинади;

з) реакцияни тўхтатиш учун тегишли чуқурчаларга 100 мкл дан стоп эритма қўшилади;

и) ҳаво бўйича Blank ўрнатилади ва 405 нм тўлқин узунлигида назоратлар ва намуналарнинг оптик зичлиги ўлчанади.

9. Тестдан ишончли натижалар олиш учун салбий назоратнинг ўртача оптик зичлиги 0,3 дан паст бўлиши шарт ва салбий назоратнинг ўртача қиймати ва ижобий назоратнинг ўртача қиймати ўртасидаги фарқ 0,15 дан юқори бўлиши шарт.

10. Лабораториядаги ҳароратнинг ўзгарувчанлиги оптик зичлик қийматининг пасайиши ёки кўтарилишига олиб келади. Бироқ намуналар қиймати назоратлар қиймати билан солиштирган ҳолда ўлчанганлиги туфайли тест натижалари ишончли бўлиб қолаверади.

11. AI ижобий назорат обдон стандартланади ва АТнинг парранда зардобидаги А1га бўлган мавжуд миқдорини акс эттиради.

12. Сўнгра парранда намуналаридаги АТнинг нисбий миқдори ижобий назорат билан солиштириш йўли билан ҳисобланиши мумкин. Ушбу ўзаро алоқа Н/И сифатида ифодаланади (намуна/ижобий назорат нисбати).

13. Намуна АТсининг АIга Н/И кўрсаткичи 0,5 ёки кўп бўлганда ижобий деб ҳисобланади.

а) Н/И нисбати қуйидагича ҳисобланади:

НЎҚ — ИЎҚ =Н/И

ИЎҚ — СЎҚ

бунда: НЎҚ — Намунанинг ўртача қиймати;

СЎҚ — салбий назорат ўртача қиймати;

ИЎҚ — ижобий назорат ўртача қиймати.

б) AT титрини ҳисоблаш

Қуйида келтирилган тенглама намунанинг 1:500 нисбатдаги аралашмасининг титри билан Н/И қийматининг нисбатини белгилайди.

Титр LoglO = 1,10 (log Н/И) + 3,156

Antilog = титр

14. Ҳар бир лаборатория иммунитет мавжудлиги ва йўқлиги бўйича ўзининг шахсий баҳолаш кўрсаткичини белгилаши шарт. Бунинг учун BioChek фирмаси томонидан тақдим этилган SE йиғмаси билан Н/И қийматини, титрларни ва паррандалар умумий ҳолатини баҳолаш учун ишлатиладиган компьютер дастуридан фойдаланилади.

15. Тест-йиғмани ишлатишда қуйидагича нохуш ҳолатларнинг олдини олиш ва эҳтиёткорлик чоралари кўрилиши шарт:

а) музлашга йўл қўйилмайди;

б) барча реагентлар билан эҳтиёткорона ишланади. Стоп-эритма таркибида кучли ўювчи ишқор мавжуд. Терига ёки кўзга тушганда кўп миқдордаги сув билан ювилади;

в) барча биологик материаллар шу жумладан барча дала намуналари билан худди хавфли материал сифатида муомалада бўлинади. Утилизациядан олдин ишлатилган планшетлар ва чиқиндилар оқартирувчи ёки бошқа кучли оксидловчи модда билан зарарсизлантирилади;

г) ҳеч қачон ҳеч нарса оғиз билан тортилмайди. Йиғма реагентлари ҳамда дала намуналари билан ишлаш белгиланган жойда ейиш, ичиш ва чекиш мумкин эмас;

д) ушбу йиғма in vitro диагностика учун белгиланган;

е) ишончли натижалар олиш учун йиғмага илова қилинган қўлланмага қатъий амал қилинади.

16. Тест-йиғма 2—8°С ҳароратда сақланади. Сақлаш муддати — 12 ой.

17. Тест-йиғма ушбу қўлланма талабларига мувофиқ келмаганда уни қўллаш тўхтатилади, бу ҳақда Республика ҳайвонлар ўта хавфли касалликлари бўйича ихтисослашган ветеринария лабораториясига қуйидаги манзил бўйича хабар берилади: 700178, Тошкент ш., А. Юнусов кўчаси, 1а уй. Тел./факс: 228-75-46, 228-73-46. E-mail: uzgnkl@rambler.ru. Шу билан биргаликда лаборатория манзилига 1-2 дона очилмаган тест-йиғма ўрами ва номувофиқлик тавсифи батафсил баён этилган хат жўнатилади.